生物材料準備
生物材料凍存前進行的準備工作可能會對凍存結果產生影響。對于非復制性材料，如組織，核酸和蛋白等，準備過程包括確認生物材料處于合適的溶液或凍存培養(yǎng)基中，此步驟的目的在于復蘇時達到zui大化的預期用途。然而，活細胞和微生物的穩(wěn)定性及復蘇活力受生長條件和凍存前準備工作的影響。
細胞凍存前需考慮多種因素，包括細胞類型、活力、生長條件、生理狀態(tài)、數(shù)目以及細胞前處理等。當建立一個新分離株或細胞系的初次種子儲備時，必須對培養(yǎng)物進行檢測并消毒，確保微生物污染的zui小化。每次準備工作后，以及每次準備新批次的培養(yǎng)物時，均要重復這個步驟。
微生物
生長于通氣培養(yǎng)條件下的微生物細胞，特別是細菌和酵母，表現(xiàn)出比生長于非通氣條件下的細胞更強的耐受冷卻和凍存?zhèn)?nbsp;的能力。T.Nei 認為，在通氣培養(yǎng)條件下，細胞通透性更好，且開放條件下培養(yǎng)細胞在冷卻過程中比非通氣條件下培養(yǎng)的細胞失水更快。另外，針對微生物細胞，在對數(shù)生長期后期及穩(wěn)定期早期獲得的細胞表現(xiàn)出更強的冰凍耐受性。從生長后期和靜態(tài)培養(yǎng)早期收集的微生物細胞比生長早期和生長晚期的細胞表現(xiàn)了更強的冰凍耐受性。
一般來講，初始凍存的細胞數(shù)目越多，復蘇率越高。對于大多數(shù)細菌和酵母而言，保證約 107/ml 的細胞數(shù)才能確保足夠數(shù)量的細胞復蘇。由于這些細胞可便捷地從瓊脂培養(yǎng)板或斜面上收集，如果需要更大量的細胞，也可使細胞生長于液體培養(yǎng)基中通過離心收集，在任何一種情況下，細胞通常懸浮在包含凍存保護劑的新鮮培養(yǎng)基中。原生生物可以通過離心濃縮，但通常需要懸浮于使用的培養(yǎng)基中，之后使用等體積含凍存保護劑的新鮮培養(yǎng)基稀釋。
針對芽孢菌凍存，需要收集芽孢并重懸于含凍存保護劑的新鮮培養(yǎng)基中。凍存前，必須縮短操作時間且確保芽孢并未萌發(fā)。針對非芽孢菌凍存，凍存前需采用特殊程序收集菌絲體。某些具硬菌絲體的真菌，需將含有菌絲體的瓊脂塊從培養(yǎng)基中切出，并將其置于含凍存保護劑的新鮮培養(yǎng)基中。硬菌絲體無法與瓊脂培養(yǎng)基很好粘附，生長于肉湯培養(yǎng)基中時，凍存前需將菌絲體團進行混合。
凍存材料的活力和復蘇率由凍存前后的培養(yǎng)和生長狀態(tài)決定?；盍κ呛饬颗囵B(yǎng)物生長和繁殖的一項指標。例如原生生物材料等某些材料，需經(jīng)過多次傳代才能保證其穩(wěn)定性。復蘇細胞數(shù)量的估算有多種方法，包括連續(xù)稀釋，平板計數(shù)或直接細胞計數(shù)。通過對比凍存前和復蘇后細胞數(shù)量的差異，可說明細胞復蘇程度 或凍存過程是否成功。
在線咨詢